Reichelt Chemietechnik Magazin
Proteine sind hochmolekulare Eiweißkörper und fundamentale Bausteine der belebten Natur. Sie stehen vor allem im Blickpunkt medizinischer und biochemischer Forschungsrichtungen. Eine hier immer wiederkehrende Aufgabe ist die Proteinreinigung aus Zellaufschlüssen und anderen Provenienzen für weiterführende in-vitro Untersuchungen. Als ein unverzichtbares Verfahren dafür hat sich die Dialyse etabliert, mit der niedermolekulare Stoffe, wie Salze oder Fragmente von Proteinen und Nukleinsäuren, von hochmolekularen Proteinen schonend abgetrennt werden können. Dialyseschläuche, Dialysemembrane und Dialysezellen sind dafür notwendig.
Funktionsweise der Dialyse zur Proteinreinigung
Diese Stofftrennung beruht auf der Diffusion von gelösten Stoffen unterhalb bestimmter Molekülgrößen durch semipermeable Membranen, die von größeren Molekülen nicht passiert werden können. Eine semipermeable Membran ist demzufolge mit einem Sieb vergleichbar.
Die Proteinreinigung durch Dialyse verfolgt das Ziel, niedermolekulare Stoffe aus proteinhaltigen Lösungen schonend abzutrennen, wie Salze, niedere Peptide, Aminosäuren und andere unerwünschte niedermolekulare Verbindungen aus vorangegangenen Arbeitsschritten.
Der selbsttätig ablaufende Dialyseprozess erfolgt stets von der höheren zur niederen Konzentration. Dabei wird zwischen Gleichgewichtsdialyse und Durchflussdialyse unterschieden.
Die Gleichgewichts-Dialyse ist technisch sehr einfach zu realisieren. Der Prozess endet mit dem Erreichen gleicher Konzentrationen der diffusionsgängigen Niedermolekularen in den Lösungen beiderseits der semipermeablen Membran, im Retentat (lat. retinere = zurückhalten) und Permeat (lat. permeare = durchlaufen). Um das Verfahren fortzuführen, muss die Konzentration der bereits abgetrennten, niedermolekularen Stoffe in der Lösung, also im Permeat, verringert werden. In der Praxis wird das Permeat in zeitlichen Abständen immer wieder durch reines Wasser ersetzt.
Die Durchfluss-Dialyse erlaubt einen kontinuierlichen Diffusionsprozess, in dem durch ständige Spülung der Permeatseite mit reinem Wasser die Einstellung des Stoffgleichgewichts zwischen Retentat und Permeat verhindert wird.
Ein grundlegendes Maß für die Filterwirkung von Dialysemembranen ist ihre Porengröße oder gleichbedeutend, ihre Porenweite. Da die Poren jedoch keineswegs alle gleichgroß sind, ist die Angabe einer exakten Porengröße von Dialysemembranen weder sinnvoll noch praktisch möglich. Sie ist demzufolge als Maßgröße für die Filtereffektivität untauglich. Aus diesem Grund wird statt dieser die Ausschlussgrenze MWCO (molecular weight cut off) verwendet. Sie entspricht der Masse von kugelförmig angenommenen Makromolekülen, die eine vorgegebene, semipermeable Membran zu mindestens 9/10 zurück hält und wird in der Masseneinheit Dalton (Da) angegeben.
Ein Dalton entspricht definitionsgemäß einem zwölftel der Masse des stabilen Kohlenstoff-Isotops C12. Wegen der sehr geringen Größe dieser SI-konformen Maßeinheit ist die Angabe des MCWO-Wertes in Kilodalton (kDa) üblich.
Proteinreinigung mittels Dialyseschläuchen
Für die Dialyse größerer Substratmengen haben sich Dialyseschläuche aus hydrophilen Polymeren bewährt, etwa aus regenerierter Cellulose, Cellulosehydrat (Cellophan®) oder Cellulose-Estern.
Die Schläuche gleichen funktionell den Membranen und sind in verschiedenen Katalogen meist als sogenannte „Flachbreite“ angegebenen Durchmessern mit unterschiedlichen MWCO-Werten bis 20 KDa verfügbar.
Dialyseschläuche werden fast ausschließlich vorgequollen angeboten. Um Schädigungen des Materials während der Lagerung durch Befall mit Schimmel und anderen Mikroorganismen sicher auszuschließen, werden sie vom Hersteller mit einer 0,05 % wässrigen Natrium-Azidlösung (Na3N) stabilisiert. Deshalb müssen sie vor ihrem Einsatz auf jeden Fall ausreichend gewässert werden, um den leicht löslichen Biostabilisator auszuwaschen. Andererseits muss das Austrocknen der Schläuche unbedingt vermieden werden, da sie mit dem Austrocknen brüchig werden und ihre Funktionsfähigkeit einbüßen.
Die zunächst durch Verknoten oder mittels spezieller Klemmen einseitig verschlossenen Dialyseschläuche mit dem entsprechenden MCWO-Wert und ausreichender Dimensionierung werden mit der zu dialysierenden Lösung gefüllt und sodann auch am Einfüllende abgedichtet, am einfachsten auch durch Verknoten. Die Dialyse wird nach Einbringen des so vorbereiteten Schlauchs in ein Wasserreservoir in Gang gesetzt. Je nach technischer Einrichtung kann die Proteinreinigung als Gleichgewichts-Dialyse oder Durchfluss-Dialyse ablaufen.
Als Wasserreservoir werden zweckmäßig eigens dafür gefertigte Dialysier-Zylinder verwendet. Die hohen Glasgefäße mit Deckel sind in verschiedenen Größen erhältlich und erlauben das gleichzeitige Dialysieren von mehreren Dialyseschläuchen.
Dank ihres planen Bodens können sie problemlos auch auf Magnet-Rührwerke aufgesetzt werden, um die diffusionsbestimmte Dialyse zu beschleunigen.
Dialyseschlauch-Trichter
Solche Trichter vereinfachen die Handhabung von Dialyseschläuchen erheblich, weil deren Einfüllende nicht mehr verschlossen werden muss. Die Schläuche werden auf den abgestuften und damit für alle üblichen Schlauchdurchmesser (Flachbreiten) geeigneten Trichterauslauf gezogen und mit einem Gummiring fixiert.
Nach dem Einfüllen des Substrats verbleibt der Trichter am Dialyseschlauch und wird mit einem Deckel verschlossen. Mittels eines integrierten Hakens wird der so präparierte Schlauch in einen Dialyse-Zylinder oder ein anderes, wassergefülltes Gefäß eingehängt.
Der Deckel des Trichters kann ohne weiteres beschriftet werden, so dass auch bei gleichzeitiger Dialyse mehrerer unterschiedlicher Substrate Verwechslungen vermieden werden können.
Dialysierschlauch-Verschließer aus Hostalen®
Zum sicheren Verschließen werden wiederverwendbare Verschlussklemmen aus farbigem, biokompatiblem Hostalen® (Polypropylen, PP) angeboten. Sie sind gut handhabbar und für unterschiedlich dimensionierte Dialyseschläuche geeignet.
Ihr vor allem für die Präparation größerer Mengen nicht zu vernachlässigender Nutzen liegt darin, dass im Gegensatz zum herkömmlichen Verknoten kaum Schlauch verloren geht, da die Verschlussklemmen sehr nahe am Ende des Schlauches angesetzt werden können. Zudem dichten die Klemmen den Schlauch sehr zuverlässig ab und schließen Undichtigkeiten als Folge von mechanischen, meist unbemerkten Rupturen beim Verknoten oder zu locker ausgeführten Verknotungen weitgehend aus.
Proteinreinigung mittels Dialysezelle
Der Einsatz von Dialysezellen mit Dialysemenbranen zur Proteinreinigung ist vor allem für kleine Substratmengen sinnvoll. Sie bestehen aus zwei Halbzellen, gewöhnlich aus klarem Acrylglas, die durch eine problemangepasste Dialysemembran voneinander getrennt sind.
Dialysezellen sind bei grundsätzlich gleichem Aufbau sowohl für die Gleichgewichts- als auch Durchfluss-Dialyse geeignet. Nachteilig ist die Empfindlichkeit von Dialysemembranen gegenüber größeren Druckbelastungen und mechanischen Einwirkungen.
Dialyse zur Proteinreinigung – zwei Optionen: Dialyseschläuche oder Dialysezellen
Die Proteinreinigung durch Dialyse soll unerwünschte, niedermolekulare Stoffe aus proteinhaltigen Lösungen unterschiedlicher Provenienz entfernen. Hierfür kommen semipermeable Membranen mit unterschiedlichen Trenngrenzen zum Einsatz, die für die größeren Protein-Moleküle unpassierbar sind. Man unterscheidet die Gleichgewichtsdialyse und die Durchflussdialyse.
- Eine nahezu universal einsetzbare, apparativ sehr einfache und daher weit verbreitete Methode basiert auf dem Einsatz von Dialyseschläuchen zur Proteinreinigung. Sie wird vorwiegend als Gleichgewichtsdialyse eingesetzt.
- Alternativ können auch Dialysezellen eingesetzt werden. Hierbei wird zwischen zwei Halbzellen aus Acrylglas, jeweils für das Retentat und Permeat, eine semipermeable Membran gespannt. Dialysezellen werden vorwiegend für die Durchflussdialyse eingesetzt.
